Espectrofotômetro - Princípio
O Espectrofotômetro utiliza a técnica da espectrofotometria para medir o quanto uma substância química absorve de luz, medindo a intensidade dessa luz quando um feixe passa pela solução da amostra. O princípio básico é que cada composto absorve ou transmite luz em um determinado intervalo de comprimento de onda. Essa medição também pode ser usada para medir a quantidade de uma substância química conhecida. A espectrofotometria é um dos métodos mais úteis de análise quantitativa em vários campos, como química, física, bioquímica, engenharia de materiais e química e aplicações clínicas.
Espectrofotômetro - Introdução
Cada composto químico absorve, transmite ou reflete luz (radiação eletromagnética) em um determinado intervalo de comprimento de onda. A espectrofotometria é uma medida de quanto uma substância química absorve ou transmite. A espectrofotometria é amplamente utilizada para análises quantitativas em várias áreas (por exemplo, química, física, biologia, bioquímica, engenharia de materiais e química, aplicações clínicas, aplicações industriais, etc). Qualquer aplicatição que trate de substâncias ou materiais químicos pode usar essa técnica. Em bioquímica, por exemplo, é usado para determinar reações catalisadas por enzimas. Em aplicações clínicas, é usado para examinar sangue ou tecidos para diagnóstico clínico. Existem também diversas variações da espectrofotometria, como espectrofotometria de absorção atômica e espectrofotometria de emissão atômica.
Um espectrofotômetro é um instrumento que mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvidos depois que passam pela solução da amostra. Com o espectrofotômetro, a quantidade de uma substância química conhecida (concentração) também pode ser determinada medindo a intensidade da luz detectada. Dependendo da faixa de comprimento de onda da fonte de luz, ela pode ser classificada em dois tipos diferentes:
- Espectrofotômetro UV-visível : usa luz na faixa ultravioleta (185 - 400 nm) e faixa visível (400 - 700 nm) do espectro de radiação eletromagnética.
- Espectrofotômetro de IV : usa luz na faixa do infravermelho (700 - 15.000 nm) do espectro de radiação eletromagnética.
No espectrofotômetro visível, a absorção ou a transmissão de uma determinada substância pode ser determinada pela cor observada. Por exemplo, uma amostra de solução que absorve luz em todas as faixas visíveis (ou seja, não transmite nenhum dos comprimentos de onda visíveis) parece preta em teoria. Por outro lado, se todos os comprimentos de onda visíveis são transmitidos (ou seja, não absorve nada), a amostra da solução parece branca. Se uma amostra de solução absorver luz vermelha (~ 700 nm), ela aparecerá verde porque o verde é a cor complementar do vermelho. Os espectrofotômetros visíveis, na prática, usam um prisma para estreitar uma certa faixa de comprimento de onda (para filtrar outros comprimentos de onda) de modo que o feixe de luz específico passe por uma amostra de solução.
Como funciona um Espectrofotômetro
Um espectrofotômetro, em geral, consiste em dois aparelhos; um espectrômetro e um fotômetro. Um espectrômetro é um dispositivo que produz, normalmente dispersa e mede a luz. Um fotômetro indica o detector fotoelétrico que mede a intensidade da luz.
- Espectrômetro : Produz uma faixa desejada de comprimento de onda de luz. Primeiro, um colimador (lente) transmite um feixe reto de luz (fótons) que passa por um monocromador (prisma) para dividi-lo em vários comprimentos de onda (espectro) componentes. Em seguida, um seletor de comprimento de onda (fenda) transmite apenas os comprimentos de onda desejados.
- Fotômetro : depois que a faixa desejada de comprimento de onda da luz passa pela solução de uma amostra em cubeta, o fotômetro detecta a quantidade de fótons que é absorvida e, em seguida, envia um sinal para um galvanômetro ou um display digital.
Você precisa de um espectrômetro para produzir uma variedade de comprimentos de onda porque diferentes compostos absorvem melhor em diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, o p-nitrofenol (forma ácida) tem a absorbância máxima em aproximadamente 320 nm e o p-nitrofenolato (forma básica) absorve melhor a 400nm.
Espectrofotômetro - Lei de Lambert-Beer
A Lei de Beer-Lambert (também conhecida como Lei de Beer) afirma que existe uma relação linear entre a absorbância e a concentração de uma amostra. Por este motivo, a Lei de Beer só pode ser aplicada quando existe uma relação linear. A Lei de Beer é escrita como:
A = ϵ l c
Onde
- A é a medida de absorbância (sem unidades),
- ϵ é o coeficiente de extinção molar ou absortividade molar (ou coeficiente de absorção),
- l é o comprimento do caminho ótico, e
- c é a concentração.
O coeficiente de extinção molar é dado como uma constante e varia para cada molécula. Uma vez que a absorbância não carrega nenhuma unidade, as unidades para ϵ deve cancelar as unidades de comprimento e concentração. Como um resultado, ϵtem as unidades: L · mol - 1 · cm - 1 . O comprimento do caminho ótico é medido em centímetros. Como um espectrômetro padrão usa uma cubeta com 1 cm de largura,l sempre considerado igual a 1 cm. Desde a absorção, ϵ, e o comprimento do caminho são conhecidos, podemos calcular a concentração c da amostra.
Importância da Calibração de Espectrofotômetros UV-Vis
Após o procedimento de calibração de espectrofotômetros UV-Vis é possível determinar se o equipamento está dentro dos parâmetros especificados pelo fabricante e assim apto para uso. Ainda é possível determinar se o equipamento atende as necessidades das aplicações das rotinas de análise.
A Labnova é especializada na Calibração de Espectrofotômetros UV-Vis, atendendo Indústrias, Institutos de Pesquisa e Universidades em todo o Brasil.
Normas ASTM e artigos NIST relacionadas
ASTM E387-04 (2014), Método de Teste Padrão para estimar Rácio Stray Radiant Power of dispersivos Spectrophotometers pelo método do filtro opaco, ASTM International, West Conshohocken, PA, 2014, www.astm.org
ASTM E925-09 (2014), a prática padrão para monitorar a calibração de espectrofotómetros ultravioleta-visível cuja largura de banda espectral não seja superior a 2 nm, ASTM International, West Conshohocken, PA, 2014, www.astm.org
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